凍結プロトコル

凍結プロトコル：培養細胞の凍結保存と凍結方法

細胞の凍結保存は細胞研究において極めて重要な技術であり、貴重な細胞をその生存能力と機能性を維持したまま長期間保存することができます。しかし、適切な凍結方法と凍結プロトコルで実施しないと、凍結プロセスが細胞にダメージを与え、その結果、細胞の生存率が低下し、研究成果が損なわれる可能性があります。最良の結果を得るためには、一貫した凍結プロトコルに従うことが不可欠です。この記事では、細胞の種類に合わせた凍結保存の一般的な凍結プロトコルや凍結方法、ガイドラインをご紹介します。正確な詳細については、細胞培養業者からの具体的な説明書をご参照ください。

凍結保存の準備

凍結プロトコルに入る前に、自分と細胞を守るために必要な予防措置をとることが重要です。常に個人用保護具を着用し、すべての手順を無菌的手法で行います。細胞に接触する器具や実験材料はすべて、適切に滅菌されていることを確認します。層流フードの中で作業することで、コンタミネーションのリスクを最小化する制御された環境を作り出します。

培地交換

凍結プロトコルの最初のステップでは、凍結保存のために細胞を準備します。まず細胞を遠心分離して培養容器の底に集めます。次に、使用済み培地を注意深く取り除き、適切なバッファーで細胞を洗浄し、適切な凍結培地を入れた凍結バイアルに再懸濁します。この凍結培地は、ジメチルスルホキシド（DMSO）やグリセロールのような凍結保護剤を含む必要があります。凍結培地の選択は、細胞の種類によって異なることがあります。

凍結プロセス

凍結プロセスそのものが、細胞の生存と回復に重要な役割を果たします。細胞が冷却される速度は、完全性に大きな影響を与えます。急激な温度低下は細胞内氷の形成につながり、細胞膜を損傷する可能性があります。一方、冷却速度が遅いと、塩濃度が高くなるため、化学的毒性が生じる可能性があります。

最適な冷却速度は通常、毎分-1℃前後です。しかし、細胞膜の透過性や表面対体積比などの様々な要因を考慮することが重要です。安定した結果を得るためには、制御された速度の凍結装置を使用し、温度を徐々に下げることが有効です。凍結速度制御装置の中には液体窒素を使用するものもありますが、マイコプラズマ汚染のリスクや問題を引き起こす可能性があります。例えば、Strex CytoSAVER プログラムフリーザー FZ シリーズは、液体窒素を使用しないソリューションで、凍結プロセスを簡素化します。

プログラムフリーザーを使用できない場合は、イソプロパノールチャンバーや断熱フォームを利用することもできます。細胞を入れたクライオバイアルをこのようなセットアップに入れ、-80℃のフリーザーに一晩放置すると、熱伝導を遅くすることにより、推奨されている毎分-1℃の冷却速度を模倣できます。しかし、この凍結方法では結果に一貫性がないことに注意することが重要です。

凍結保存

細胞が凍結したら、-80℃フリーザーや液体窒素タンクなどの長期保存施設に速やかに移します。移送中、細胞の凍結状態を維持するためにドライアイスを使用することが推奨されます。解凍すると細胞に悪影響を及ぼす可能性があるため、クライオバイアルの取り扱いは慎重に行うことが重要です。細胞を使用する準備ができたら、室温で急速解凍することができます。