大阪市中央区南船場｜医薬研究用機器および医療関連機器の企画・開発・製造・販売
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 オートクレーブは問題ありませんが、アルミホイルは使用しないでください。滅菌専用バッグを使用しています。 
ストレッチチャンバーの材質はPOLYDIMETHYLSILOXANEを主体としたシリコンエラストマーです。表面は疎水性が強く、低細胞接着性です。細胞培養のためには培養面の細胞接着性を高めるために細胞外基質（ファイブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ゼラチンなど）でコーティングをして細胞培養を行います。（コーティング方法を参照ください）
持続的に細胞を伸展させた場合と周期的な伸展刺激を負荷した場合、細胞内で異なるシグナル伝達系を刺激することが報告されています。 (Ref)Sasamoto et al,2005,288,C1012-22
独自の伸展方式、モーターとプログラムの特性、ならびにストレッチチャンバーの材質、形状などの特性により可能となっています。これに対し、チャンバーを吸引することにより伸展させる方式では、チャンバー内の全細胞について伸展刺激の方向ならびに強度を均一にすることはできません。
ご存知だとは思いますが、このときのプラスティックシャーレは、浮遊細胞用ディッシュ、または細菌培養用ディッシュを使用してください。 接着細胞用ディッシュでは、たとえ、ファイブロネクチンがうまくコートされなくても非特異的に接着してしまいます。 ストレックスから発送している商品は滅菌されておりません。特に、洗浄は必要ありません。
大量培養用ストレッチも生産しています。（受注生産品）従来機でもフックを交換すれば、倍のチャンバーをセットすることができます。 この場合ですと、二段重ねで ６X２＝１２個のチャンバーを同時に伸展刺激を与えることができます。 一度に搭載できるチャンバー数を指定して頂ければ最適方法で見積もり致します。
ミネラルオイル・フォンブリンオイル・テフロンオイル等をフックに塗っていただきますと抜き差ししやすくなります。
ストレッチチャンバーに細胞を撒く時にストレッチチャンバーの底面にしわ、または気泡などがある状態で撒いてないですか？ストレッチチャンバー底面は基本的にしわなどが無いように注意を払い製作していますが、きわめて薄い為、微妙にしわがあるものもあります。そこで、ストレッチチャンバーをディッシュ内に置くときに、先ずディッシュ上にエタノールを少量垂らし、ストレッチチャンバーとディッシュの間に空気が入らないように傾けながら置き、しばらく放置してエタノールを蒸発させることにより最適な状態で細胞を撒くことができます。
一般的に細胞がオーバーコンフルエントになると細胞間接着力が細胞ー基質間接着力を上回り剥がれる傾向があるようです。細胞を多く撒きすぎると、細胞分裂後に隣接する細胞同士が接着してしまいます。これは通常ディッシュでも見られますが、ストレッチチャンバー上ではその傾向が顕著です。細胞の撒く量を減らしてリトライしてみて下さい。 また、酵素処理（特にトリプシン）などにより細胞にダメージがある場合ですが、通常ディッシュでは非特異的結合により一見接着しているように見えます。しかしストレッチチャンバー上ではコーティングした細胞外基質のみでの接着ですのでかなりシビアに処理をしないといけません。酵素処理時間・濃度・温度など最適化する必要があります。細胞にダメージがあり、コーティングが充分でない場合には、細胞を接着させることはできません。コーティング時間を長くしてみて下さい。また、弊社では確認できていませんが、複数の試薬を配合しコーティングしている研究者もいるようです。
インキュベーターの振動により、細胞がストレッチチャンバーの中央に集まることがあります。その場合には、細胞を撒いた15分後に、ストレッチチャンバーを軽く、ゆっくりと、左右に傾けながら揺すってみて下さい。
UV当てながらのコーティングはタンパク質が変性してしまいます。37度でインキュベータに入れてコーティングしてください。
オートクレーブはせず、フィルターを通す方法でお願いいたします。
細胞にもよりますが、インキュベーター内で２週間は可能です。但し２～３日に１回程度培養液の交換が必要です。その為の培養液自動管理装置もご用意しております。また、長期培養時は、モータ冷却水の量が充分かどうかの確認も必要です。冷却水の量が不十分な場合には、モータ周辺部の温度が上昇し細胞が死滅してしまったり、装置が破損する場合があるので、注意が必要です。
ランゲンドルフ還流での急性単離標本でしょうか。またはいったん培養したものでしょうか。 我々は、いったん培養したものを使用しています。
通常のプラスティックシャーレなどは表面のチャージによって非特異的に接着しているために細胞状態が少々悪くてもなかなかはがれることはありません。しかし、ストレッチチャンバーの材質は Polydimethylsiloxaneのエラストマーですから表面はほとんどCH3基があり、非常にHydrophobicで、且つ、そのままでは細胞はほとんど接着することはありません。したがって、細胞ー細胞外基質間接着によるもののみであり、ここを逆手にとって我々は種々の細胞外基質との相互作用を知ることが出来ます。 【細胞の状態】 細胞の状態が接着性に大きな影響を与えます。特に細胞の取り扱いに細心の注意を払わなければなりません。トリプシンで細胞をディッシュから剥がしていると思いますが、濃度は極力低目できわめて短時間（数十 秒）で処理し、細胞が変形し始めたのを顕微鏡で確認次第、壁などにシャーレを打付けて機械的に剥がします。トリプシン反応を停止させるために氷冷した培養液を即座に加えピペッティングにより細胞を分散させます。ここまでの手技が確実に出来るのであればストレッチチャンバーにまいてから10-30分の間に細胞はきれいに伸展接着します。 【細胞の種類】 お問い合わせのうち、NIH3T3,C2C12は使用経験があり50時間ではがれることはなかったと思います。NIH3T3の論文を添付します。この論文では実際に50時間以上培養した実験結果を載せてありませんが、問題ありませんでした。また、C2C12細胞に関しては下記のとおり培養しており、これもはがれることなく培養できています。 【細胞密度】 細胞種にもよりますが、細胞間結合力が細胞ー細胞外基質間接着力を上回るとシート状になって剥がれてきます。通常confluent状態では問題ありませんが、過度のconfluent状態で長らく培養した場合、シート状になってはがれる場合があります。 【Fibronectin】 チャンバーへの細胞の接着は、100μg/mlのFibronectin (SIGMA F1141Fibronectin0.1% solution,From Bovine plasma)とのことですが、この濃度であれば問題ありません。但し我々は自家調整したヒトFibronectinを使用しています。Fibronectinの処理条件は如何でしょうか？通常は37度、30分で良好な結果を得ています。接着性が悪い場合は時間を数時間に伸ばすことで対応できます。Fibronectin処理後、Fibronectin液を吸引したときストレッチチャンバー表面は一面ぬれた感じになっていますか？直ぐはじくようであれば、コーティングされていないことが考えられます。最近、新しいチャンバーが送られたと思います。表面に非特異的チャージ処理をしてありますので接着性はあがっているはずです。しかし、細胞外基質による結合だけではありません。 【C2C12細胞条件-抜粋】 [Cell culture] Dr. Takashi Obinata (Department of Biology, Chiba University,Chiba, Japan) kindly supplied us with a subclone of the mousemyogenic (myoblastic) cell line (53), C2C12. Cells were maintained as undifferentiated myoblasts in high glucose (4.5 g/ l) DMEM containing 15% FBS (vol/vol) in a tissue culture incubator at 37℃ in a humidified atmosphere of 5% CO2 and 95% air. The cells were passaged when they reached the state of about 70% confluency, and the medium was changed three times a week. For the experiments, C2C12 myoblasts were removed from the culture dish with 0.01% EDTA-0.25% trypsin and transferred to a 10 cm2 elastic silicone chamber (used for the 2-deoxy-D-glucose uptake assay), or to a 1 cm2 elastic silicone chamber (used for Ca2+ measurements) at a density of 2.0×104 cells/cm2. All chambers had a 200 m thick transparent bottom on which the cells were cultured. The bottom had been precoated with 0.05% porcine type I collagen (Koken, Tokyo, Japan). After 2 days of incubation, the myoblasts were found to be confluent. At this point, to induce the differentiation of myoblasts into myotubes, the culture medium was replaced with low glucose (1.0 g/l) DMEM containing 5% HS (vol/vol), which was changed every other day. Fully differentiated myotubes were attained 7 days after seeding the cells. 2-day-old myoblast cells and 7-day-old myotube cells were used for the following experiments. （参考論文：Calcium regulates the PI3K-Akt Pathway in stretched osteoblasts）
先回お示しした方法で細胞を剥がしていますよね？この実験系では細胞の取扱いが非常に重要になってきます。この段階でC2C12細胞を分化させていませんよね？他の研究室でも確認しましたが、同じ細胞を用いて問題なく接着し実験できています。 50-100μg/mlであれば問題なく接着します。コラーゲン処理の場合、PBSなどで洗浄しましたよね？pHが問題になるときがあります。ゼラチンの方が使用しやすい場合があります。
3T3L1細胞伸展刺激の経験はありませんが、共同研究者が以前伸展刺激を与えていましたので問題ないと思います。伸展可能シリコンゴム上での培養システムですので、接着細胞であれば伸展刺激を与えることが出来ます。ただしご指摘のように浮遊してしまうともはや伸展刺激を与えることは出来ません。
弊社の『すとれっち』シリーズはシリコン系エラストマー（ＰＤＭＳ）の上に細胞を培養し、エラストマーを伸展することにより細胞を伸展します。従って、接着可能な細胞を前提としたシステム構成になっており、いわゆる血液からのshearstressをこのシステムで負荷することは困難です。Shear stressに関してはmicrofluidicsを利用したシステムがありますが、これも付着細胞を使用しないと定量的なshear stressを与えることが出来ません。
ストレッチチャンバー上で直接遺伝子導入することもできます。しかし、導入操作自身で細胞がダメージを受けますのできれいな画像をとることが難しいので一度ディッシュ上で導入を行った後、ストレッチチャンバー上に播きなおした方がベターだと思います。
(1) ウエスタンブロッティング：PBSで洗浄後、電気泳動用sample bufferを直接ストレッチチャンバー加え、セルスクレーパーにて細胞溶解液を回収することができます。 (2) Immunoprecipitation（免疫沈降）： PBSで洗浄後、細胞可溶化液を直接ストレッチチャンバー加え、セルスクレーパーにて細胞溶解液を回収することができます。 (3) mRNA：RNA用PBSで洗浄後、可溶化液を直接ストレッチチャンバー加え、セルスクレーパーにて細胞溶解液を回収することができます。
固定時にアセトン・クロロフォルムを使用すると若干シリコン膜が膨張する可能性があります。メタノールなどは問題ありません。 予めシリコンチャンバー膜を5mm×5mm程度に切り出しておけば操作は簡単です。観察時にはカバーグラス上に細胞面を向けて（下向き）に乗せるときれいに観察することが出来ます。
水浸レンズをご使用下さい。油浸レンズをご使用の場合はチャンバー膜面を切り取ってカバーガラスの上に置いて下さい。油がつくと、ゴムが膨張して見にくくなります。
勿論です。以下に、Ｔｉｐｓを記しておきます。 ・染色するためにはメス刃にてチャンバーから5ｍｍ四方の小片として切出すと扱いやすい。 ・染色後は、封入液を一滴たらしたスライドガラスの上に、細胞面が下になるように気泡が入らないように乗せる。更にもう一枚小さめのカバーグラスで覆いサンドイッチにすると観察しやすい。
可能です。通常は、細胞シートを伸展できる 細胞シートクランプで伸展します。又は、２重構造のトランスウエル伸展で 内側のチャンバーシートを生体膜に交換することもできます。
ＳＴＢ-１４０を使用しての顕微鏡写真撮影は難しいので、金属棒が4本立った支持台を利用すれば伸展状態の細胞の撮影することが可能です。またHPの伸展後の顕微鏡写真ですが、蛍光染色写真の方は1時間伸展刺激を加えた後、伸展装置から取り外して、つまりリラックスした状態で固定⇒染色した像です。伸展中の写真をご希望であれば、上記方法で撮影するか、顕微鏡上伸展システムを使用をお勧めします。伸展刺激後にRNA抽出、Western Blottingは問題なく出来ます。しかし、チロシンリン酸化反応などを見たいのであれば、しかるべき脱リン酸化酵素阻害処理をしておかないと経時的に反応が減弱することがあります。
金属棒が4本立った支持台の利用というのは、シリコンチャンバーをセットした4本の金属棒（本体のブラケットにシリコンチャンバー分立っているピン）と同位置に金属棒4本を設定できる支持台を設計し、伸展実験後にブラケットの金属棒から支持台の金属棒へチャンバーをスライドさせるということでしょうか？ ⇒いわゆるstatic stretch用のチャンバー把持台があります。ご希望の伸展度（例えば120％など）を指定いただければ用意できます。 また、伸展後にブラケット（上記の、シリコンチャンバーセットのための金属棒が立った金属板）2枚の間の位置を何らかの方法で固定してブラケットを本体から取り外し顕微鏡下に置くという方法についてはどうお考えでしょうか。この場合、本体とブラケットの装着、脱着を繰り返すことになりますが、問題点等ありますでしょうか。 ⇒慣れれば問題ないと思います。実際、私のところの大学院生は2枚のブラケット両サイドの間にアルミ片を渡し、紙バサミ（黒いクリップ？）で固定して取り外しています。または、ブラケットごと本体から取り外してから開創器で所定の伸展度まで開いた後、アルミ片を渡して紙バサミで固定します。ただし、なれないとちょっと難しいかもしれません。 |
